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环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）是一种抗真菌抗生素，通过阻断真核细胞的蛋白质合成发挥其广谱活性，是分子生物学研究中常用的一种转录翻译抑制剂。
1. 概述
环己酰亚胺，又称“放线菌酮”，是一种由链霉菌（Streptomyces griseus）产生的天然化合物。其编号为CAS 66-81-9，分子式C₁₅H₂₃NO₄，分子量为281.35。由于其良好的溶解性（可溶于DMSO（100mM）、乙醇（50mM）和水（25mM）），被广泛用于实验室研究。
2. 作用机制
·靶点与效应：CHX是一种特异性的真核生物蛋白质合成抑制剂，但对原核生物无效。其作用靶点位于核糖体的60S亚基，通过在蛋白质翻译的延伸阶段干扰“易位”步骤，阻止信使RNA（mRNA）的移动，从而不可逆地阻断新生肽链的延伸。
·抑制活性数据：在众多研究中，CHX的活性得到了量化：
o蛋白质合成：体内实验的半数抑制浓度（IC₅₀）为532.5 nM。
oRNA合成：在抑制蛋白质合成的高浓度下，CHX也能对RNA合成产生二次效应，其IC₅₀为2880 nM。
o其他活性：它还对多种细胞系有抑制作用，例如对人T细胞白血病细胞CEM的IC₅₀为0.12 μM。
3. 功能与应用
CHX的作用是快速且可逆的，移除药物即可恢复蛋白质合成，这使其成为研究蛋白质功能和调控的强大工具。
应用领域 | 具体用途 | 简要原理 |
蛋白质半衰期测定 | CHX追踪实验(Cycloheximide chase assay) | 加入CHX全局阻断新蛋白合成后，通过Western Blot等技术追踪某一特定蛋白随时间的衰减，从而计算其降解速率。 |
超诱导研究 | 超级诱导(Super-induction) | 通过抑制大多数“短寿命”抑制性蛋白的合成，相对地延长某些“长寿命”靶蛋白的合成时间，从而显著提高其表达水平。 |
核糖体分析 | 翻译过程“冻结” | CHX能快速将正在翻译的核糖体冻结在mRNA上，这对于核糖体图谱分析（Ribosome profiling）等研究翻译调控的技术至关重要。 |
微生物筛选 | 筛选抗性菌株 | 由于CHX只抑制真核生物，在原核生物中无效，因此常用于酵母和真菌的抗性菌株筛选。 |
细胞凋亡研究 | 诱导或促进细胞凋亡 | CHX本身可作为凋亡诱导剂，或增强肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等死亡受体的凋亡信号，用于研究细胞死亡通路。 |
植物学应用 | 植物生长调节剂 | 在农业上，低浓度的CHX曾被用作果实疏果剂或催熟剂，通过刺激乙烯产生来促进果实脱落。 |
4. 实验指导与安全信息
·溶液配制：例如，要配制50 mg/mL的储存液，可取50 mg CHX粉末溶于1 mL溶剂（如乙醇或DMSO）中。溶剂的选择应考虑下游实验的兼容性。
·工作浓度参考范围：
o细胞培养：通常为1 - 10 μg/mL。具体的最佳浓度需通过预实验（如Western Blot）在不同细胞系中进行优化和验证。
o蛋白质半衰期测定：50 - 100 μg/mL。
o酵母筛选：1 - 10 μg/mL。
·安全信息：CHX毒性很强。在使用时必须严格遵守实验室安全规程。
o剧毒：对人类经口致死剂量估计为5-50 mg/kg。
o致癌与生殖毒性：被归类为H341（怀疑会导致遗传缺陷）和H360D（可能会对胎儿造成伤害）。
o安全操作建议：
1.严禁使用移液管口吹吸。
2.接触后，用大量清水和肥皂彻底清洗受污染皮肤。
3.所有接触过CHX的废弃物（如移液器吸头、细胞培养皿）必须作为有毒化学废弃物处理。
4.操作应在化学通风橱内进行，并佩戴适当的手套、实验服和护目镜。
5. 总结
总的来说，环己酰亚胺凭借其独特的真核特异性蛋白合成抑制机制，在生物医学研究中扮演着经典工具试剂的角色。通过有效阻断蛋白质的翻译过程，它被广泛应用于测定蛋白质半衰期、研究翻译调控机制等领域。
以下是环己酰亚胺（CHX）用于动物和细胞实验的方案汇总，并附有关键注意事项。
储存液配制
项目 | 说明 |
溶剂选择 | 常用蒸馏水、PBS或DMSO。不建议使用浓度过高的有机溶剂直接处理细胞，必要时用培养基稀释至工作浓度。 |
常用储存液浓度 | - 用于细胞实验：建议配制成10 mg/mL的储存液，过滤除菌后分装冻存。 |
- 用于CHX追踪实验：可用蒸馏水配制成0.1 mol/L的储存液，-20℃保存；如不溶可微热至40℃助溶。 | |
- 用于动物实验：用0.9%生理盐水新鲜配制，现配现用。参考浓度：0.4 mg/mL。 | |
工作浓度参考 | -细胞培养：常用10～100 μg/mL。 |
-CHX追踪测定：常用35 μg/mL或50～100 μg/mL。 | |
-筛选抗性酵母/真菌：1～10 μg/mL。 |
CHX作用迅速，加入培养基后几乎立即起效。确认抑制效果可采用放射性标记氨基酸掺入试验（如³⁵S-甲硫氨酸脉冲、TCA沉淀法）。仅依赖考马斯亮蓝染色全细胞裂解物灵敏度不足。如涉及DMSO，其在终体系中的体积分数不宜过高（通常<0.1%）。
细胞实验方案
1. CHX追踪法测定蛋白质半衰期
该方法通过阻断新蛋白合成来追踪特定蛋白随时间衰减的速率，是研究蛋白质降解动力学的经典手段。
基本步骤：
·细胞准备：培养贴壁细胞至80–90%融合度（约每孔3,000–5,000个细胞）。
·CHX处理：加入CHX至终浓度35 μg/mL（或通过预实验确定最佳浓度），开始计时。
·样本收集：在0、2、4、6、8小时等不同时间点收集细胞，用PBS洗涤后裂解。裂解液可经4℃、15,000g离心5–15 min去除不溶物。
·检测与定量：通过SDS-PAGE分离蛋白质，利用目标蛋白特异性抗体进行Western Blot检测。扫描条带灰度值，绘制衰减曲线，计算半衰期。
**注意事项**：建议同时检测稳定表达的蛋白（如Tubulin, Actin）作为上样内参。所测半衰期取决于蛋白本身的降解速率，不同蛋白差异很大。
2. CHX在细胞培养中的通用方案
实验目的 | 推荐浓度 | 处理时间 | 参考文献 |
抑制新蛋白合成 | 10–100 μg/mL（常用35 μg/mL） | 5–10 min 至数小时 | |
蛋白质半衰期测定 | 50–100 μg/mL（或35 μg/mL） | 0–8 小时（逐时取样） | |
细胞生长停滞（一般用途） | 35–50 μg/mL | 持续处理，取决于实验目标 | |
快速翻译“冻结”（如核糖体分析） | 100 μg/mL | 加入后立即进入后续流程 | |
抑制真核翻译（制备粗微体） | 10 μmol/L（≈2.8 μg/mL） | 5–10 min | |
筛选抗CHX酵母/真菌菌株 | 1–10 μg/mL | 持续培养筛选 | |
诱导细胞凋亡 | 1–20 μg/mL | 数小时至24小时 |
CHX抑制蛋白质合成通常为**不可逆**作用。处理时间过长或浓度过高可能导致细胞毒性，宜根据实验目标和细胞类型进行优化。
3. 测定CHX对细胞增殖的影响
方法示例：HeLa、Jurkat等细胞悬液按每孔3,000–5,000个接种于96孔板，过夜贴壁。第二天加入0.1 nM–1000 μM的CHX（DMSO溶解），继续培养24小时。每孔加入1 μCi ³H-胸苷，继续孵育7小时。用多孔收集器将细胞收集于滤膜，闪烁计数测定胸苷掺入量。
动物实验方案
特殊应用中的小鼠给药参数汇总
实验类型 | 动物品系 | 剂量范围 | 给药途径 | 给药时机与频次 |
记忆巩固障碍模型 | 昆明小鼠 | 120–150 mg/kg | i.p. | 训练后立即或训练前10 min/30 min，单次注射 |
被动回避记忆研究 | C57BL/6J | 失忆剂量150 mg/kg；亚失忆剂量30 mg/kg；二次追加15–75 mg/kg | i.p. | 训练后0、30 min或1 h注射 |
抑制脑蛋白质合成（评估） | ICR小鼠 | 30 mg/kg抑制约80%脑蛋白合成 | i.p. | 注射后30–60 min测定 |
艾利希腹水癌细胞研究 | 常规小鼠品系 | 30–60 μg/g（即30–60 mg/kg） | i.p. / i.v. | 肿瘤细胞注射前后2–18 h给药 |
免疫调节研究 | 白色小鼠 | 12.5, 25, 50 mg/kg | i.p. / i.v. | 按注射次数给药（周期依实验而定） |
腹膜腔给药（常规参考） | 常规小鼠品系 | 0.2 mg/110 g（约1.82 mg/kg） | i.p. | 单次注射，持续观察5–10天 |
口服给药（长期低剂量） | SD大鼠 | 0.25 mg/kg | 口服灌胃 | Daily，持续5天 |
癫痫模型（匹罗卡品） | SD大鼠 | 1 mg/kg | i.p. | PILO给药前30–45 min单次注射 |
淋巴吸收研究 | SD大鼠 | 0.5 mg/kg（药代）；2.5 mg/kg（药效） | oral / i.p. / i.v. | 与脂质或药物联合给药，单次或少量多次 |
植入研究/妊娠研究 | SD大鼠 | 1 mg/kg | i.p. | 人工蜕膜诱导后立即，或妊娠第4天晚上/第5天早上单次注射 |
**备注**：i.p. = 腹腔注射；i.v. = 静脉注射；oral = 口服。
一般性给药建议
动物模型 | 常用剂量 （参考） | 给药途径 | 典型用途 | 效果参考 |
小鼠（Mus musculus） | 30–120 mg/kg | i.p. | 记忆研究、蛋白合成抑制、毒性评估 | 蛋白合成抑制80–95% |
小鼠（短期处理/低毒性） | 1–10 mg/kg | i.p. / oral | 特定组织功能研究、免疫调节 | 低毒或无可见毒性 |
大鼠（Rattus norvegicus） | 0.25–2.5 mg/kg | oral / i.p. / i.v. | 药代动力学、淋巴吸收、胚胎植入研究 | 有效抑制蛋白合成，淋巴吸收降低24–40% |
关键注意事项
1.物种特异性：小鼠与大鼠对CHX的敏感性相差悬殊。抑制大鼠蛋白合成所需的CHX剂量（1–3 mg/kg）远低于小鼠，导致遗忘所需的剂量也比小鼠低得多。大鼠的LD50值也远低于小鼠，在借鉴文献剂量时务必核实动物品系。
2. **肝毒性**：即使是相对中低剂量（如2.5 mg/kg），CHX也能引起血浆脂质显著降低（24–40%），并可能伴有炎症反应和肝酶升高（如ALT/AST），且在给药后仍可持续一周。
3. **记忆效应与剂量**：CHX诱导遗忘并非简单的剂量依赖关系，有时呈倒U型曲线。30 mg/kg的低剂量可能足以增强记忆，而更高剂量（如120 mg/kg）反而产生遗忘。给药时机（训练前、训练后立即、训练后30 min或1 h）也显著影响效果。建议将CHX作为干预剂时开展剂量−效果预实验。
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存储建议
·粉末状：-20℃保存，通常可稳定3年。
·储存液（溶剂）：-80℃保存，通常可稳定6个月以上。分装避免反复冻融。
